Oxford Nanopore测序芯片上样指南

Oxford Nanopore测序当然是在纳米孔测序设备上进行的。但更准确地说，测序本身是通过该设备上的测序芯片进行的。测序芯片制备、上样和启动测序实验都非常简单快捷。在本篇文章中，我们将带您了解整个流程。

测序芯片是Oxford Nanopore工作流程中测序阶段的耗材，内含实现测序所需的化学试剂；当加入DNA、RNA或cDNA样本后即可开展测序，其中也包括纳米孔本身。

测序芯片以电子方式连接到纳米孔测序设备，这样就可以测量DNA/RNA测序产生的电信号，并用于识别碱基序列。更多细节请阅读：深入了解Oxford Nanopore纳米孔测序技术。

在每种类型的测序芯片中，纳米孔测序化学试剂本身都包含在阵列中，阵列位于一层缓冲液之下。当您收到测序芯片时，它是充满贮藏液的，使阵列呈现黄绿色。

MinION测序芯片有两个不同的端口可以接触到这个阵列：一个是制备口，可以用来制备测序芯片；另一个是直接位于阵列上方的SpotON端口，可以通过它滴加测序文库。

PromethION测序芯片。

以下是制备测序芯片和上样的步骤。当您准备好运行测序实验时，请务必遵循此阶段的工作流程步骤（https://nanoporetech.com/documentation/results），其中将详细说明整个流程。

插入芯片

首先，将测序芯片插入测序设备。在MinION或GridION上，将MinION测序芯片滑入设备的卡扣下方，然后向下按压制备口的盖子，以确保接触良好。在PromethION上，将PromethION测序芯片滑入设备上的对接口，直至金色引脚完全不可见，然后向下按压 ，听到咔嗒一声即表示已经正确到位。

将MinION测序芯片插入MinION（左），将PromethION测序芯片插入PromethION 24（右）。

制备

接下来，滑开制备口盖子（适用于 MinION 测序芯片）或加样口盖子（适用于PromethION测序芯片），露出下方的端口。仔细观察，您会发现端口内贮藏液前方有少量空气。你需要移除该气泡（这是测序芯片的正常现象），以确保不会有空气进入阵列。

我们有一个小窍门。使用P1000移液枪，在不按压活塞的情况下，将吸头插入暴露的端口。然后，缓慢拧动移液枪活塞上的调节轮，增加刻度盘上显示的体积，直到少量缓冲液被吸入移液枪吸头，即表示测序芯片中的气泡已经被移除。

移除MinION测序芯片制备口的气泡。

制备

下一步是添加制备溶液，溶液将冲洗掉阵列中的贮藏液，确保为样本测序提供最佳条件。该步骤分两轮进行。

在MinION测序芯片上，用移液枪缓慢将第一轮冲洗的制备溶液加入制备口（也就是刚刚移除气泡的位置），然后等待五分钟。每次向MinION或PromethION测序芯片中移液时，须确保在到达移液枪活塞上的第二档之前停止，使移液枪吸头保留少量溶液。这样可以防止空气进入芯片。

对MinION测序芯片进行第一次冲洗。

然后，掀开SpotON端口盖子，露出SpotON端口。加入第二次冲洗液，但不是通过这个端口，而是通过第一次使用的制备口。在操作过程中，您会看到缓冲液在SpotON端口略微上升，然后回落到阵列中。这将再次确保端口中没有空气，为下一步做准备。第二次冲洗后再暂停五分钟。

打开SpotON端口进行第二次冲洗。

在PromethION测序芯片上，两次冲洗都要通过加样口。用移液枪将制备溶液缓慢注入该端口，等待五分钟，然后重复此过程进行第二次冲洗。

对PromethION测序芯片进行第二次冲洗。

现在，您的测序芯片已经制备完毕，可以进行测序了。